酶標儀的技術原理與操作指南

　　一、技術原理

　　酶標儀，即酶聯免疫檢測儀，是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的專用儀器。它基于光電比色法或熒光檢測法，通過測量樣本對特定波長光的吸收程度或熒光信號強度，實現對生物樣本中待測物的定性和定量分析。

　　(一)光電比色法原理

　　酶標儀的光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔板中的待測標本。單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上。光電檢測器將這些光信號轉換成相應的電信號，經過一系列信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算，最后由顯示器和打印機顯示結果。特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系，檢測單位用OD值(光密度)表示，OD值與光強度之間的關系遵循Bouger-amberT-beer法則。

　　(二)熒光檢測法原理

　　在熒光檢測中，酶標儀通過特定波長的激發光照射樣本，使樣本中的熒光物質發出熒光。光電檢測器接收熒光信號并將其轉換為電信號，經過處理后得到熒光強度值，該值與樣本中熒光物質的濃度成正比。

　　(三)波長選擇與雙波長檢測

　　在測定檢測物時，選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。但每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，再選取一個參照波長。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。例如，450nm和492nm兩個波長是目前ELISA測定最-常用的，考慮到雙波長比色的需要，還應有630nm和405nm波長的濾光片。

　　二、操作指南

　　(一)準備工作

　　儀器放置：將酶標儀、配套的電腦及主機等放在平穩、干燥的地方。

　　電源連接與預熱：將酶標儀與電腦連機，依次打開電腦和酶標儀的開關，等待自檢，預熱5 - 30分鐘(不同型號儀器預熱時間可能不同)，使儀器達到穩定狀態。在預熱過程中，可根據具體情況設置所需要的波長和光線強度。

　　軟件啟動與程序設置：打開與儀器配套的軟件，建立新的檢測程序或打開已有程序。創建新程序時，選擇所需創建的程序協議，如吸光值、化學發光、熒光強度等;選定試驗協議后，進行波長選定、酶標板選定，并設置protocol參數，如酶標板震蕩混勻樣品的時間、測量樣品結果的時間、樣品波長掃描范圍以及樣品環境溫度等。修改已有程序時，在酶標儀打開界面中選定一個protocol，然后雙擊進入程序設置界面進行相應修改。

　　(二)樣品準備

　　樣品制備與稀釋：根據實驗要求，準備好待檢測的樣品和標準品，并進行相應的稀釋和加樣。同時，應控制好稀釋倍數，避免樣品濃度過高或過低的影響。

　　微孔板布置：在酶標板中按照實驗設計布置待測和標準樣品，每個孔位加入適量的稀釋后的樣品。同時，在同一板中添加對照組和空白對照。

　　(三)試劑添加

　　根據實驗需求加入輔助試劑，如底物和酶標記等。加入試劑時需要嚴格按照實驗流程進行，按照正確的順序和比例加入試劑，避免污染和誤差。

　　(四)混勻和孵育

　　輕輕搖晃或輕輕拍打酶標儀板，確保樣品和試劑充分混合。將酶標儀板放置在恒溫條件下的孵化箱中進行相應的孵育時間，以促進反應的進行。

　　(五)反應停止和讀數

　　反應停止：在孵育結束后，根據試劑盒說明書中的指導，加入適當的反應停止劑，終止反應。

　　讀數操作：將酶標儀板放置在酶標儀中，根據所測定的具體物質選擇相應的波長或濾光片，讀取吸光度或熒光強度值。

　　(六)數據處理

　　根據實驗需要，使用軟件或計算公式將讀數結果轉化為所需的具體物質的濃度或活性。點擊電腦軟件上的“編輯"欄中的“復制到Excel"，導出數據后進行數據處理和分析。

　　(七)儀器清理與維護

　　取出酶標板：數據處理完成后，打開儀器蓋，取出酶標板。

　　儀器清潔：蓋好儀器蓋，關閉酶標儀電源，并將儀器擦拭干凈。

　　定期維護：按照設備的維護手冊，定期進行維護和檢修工作，包括校準和更換部件等。定期檢查儀器狀態，如光源是否正常、濾光片是否清潔等;儀器出現故障時，應及時聯系專業工程師進行維修，避免盲目自行設置。